A densa rede linfática profunda existente no tecido conjuntivo da pleura visceral, tanto dos folhetos peribrônquicos como dos perivasculares de todos os lobos pulmonares e da região justa-alveolar, desempenha um papel crucial na remoção de materiais estranhos e na disseminação dos tumores do pulmão1–5.

Os liposomas foram propostos como promissores sistemas de transporte de fármacos anti-tumorais, devido à sua capacidade de encapsulamento6,7. São igualmente adequados para a obtenção de imagens da rede linfática profunda, uma vez que se comportam como partículas estranhas e são drenados. Podem ser administrados através de várias vias como, por exemplo, sob a forma de aerossóis. Com base na patofisiologia da infecção pulmonar por Bacillus tuberculosis podem modular-se liposomas específicos. Estes liposomas podem ser produzidos para mimetizar a composição da parede de esporos de Bacillus subtilis (um microrganismo saprófita das vias respiratórias), de modo a serem capturados pelos linfáticos pulmonares8,9.

A metodologia utilizada permitiu a produção de vesículas unilamelares (diâmetro médio - D50 - 100nm) com um pequeno índice de polidispersão (0,17; n=3), e uma carga de superfície de – 45,8mV (n=3), confirmada pela determinação do potencial zeta e por espectroscopia de correlação fotónica.

A eficiência de marcação da formulação liposomal foi testada com microcromatografia instantânea ascendente de camada fina (ITLC-SG) com soro fisiológico. A média de eficiência de marcação obtida para 99mTc-Exametazima foi de 74,1±13,9% (n=12). Os estudos de estabilidade in vitro previamente referidos mostram-se na figura 1A. A eficiência de marcação de 99mTc-Exametazima-liposomas foi boa, mas a característica mais importante foi a sua estabilidade in vitro na presença de soro humano, plasma humano e solução de albumina ser superior à estabilidade nas fracções sanguíneas.

Figura 1.

Estabilidade dos liposomas. A) A eficiência de marcação (%) após incubação com diferentes fluidos (soro fisiológico, soro humano, plasma, solução de albumina humana com uma concentração de 4mg/ml), antes e após o aquecimento a 56°C por 30min, para inactivar o complemento das fracções sanguíneas. B) Avaliação temporal da perda do núcleo aquoso pelos liposomas, utilizando ITLC-SG ascendente com soro fisiológico.

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A formulação liposomal foi administrada sob a forma de aerossol e a sua eficiência de marcação (após 3min de acção dos US) não foi significativamente diferente dos valores determinados pré- e pós-exposição aos US. O estudo da perca de conteúdo aquoso, durante 5,5h após o segundo ITLC-SG, mostrou uma boa estabilidade antes e depois da ultrasonicação (fig. 1B).

Os estudos cintigráficos dinâmicos, tanto com a inalação de aerossóis de 99mTc-Exametazima como com 99mTc-Exametazima-liposomas, mostraram uma boa deposição no pulmão, confirmando que os liposomas produzidos atingem as vias respiratórias de pequeno calibre e, assim, a superfície alveolar.

Os gânglios linfáticos axilares foram visualizados 30min pós-inalação. 1h pós-inalação tornaram-se mais evidentes e os nódulos linfáticos aórticos abdominais e inguinais foram também observados. Imagens tardias não trouxeram informação adicional, embora se observe actividade nos órgãos abdominais (fig. 2).

Figura 2.

Sequência de imagens obtidas aos 30, 60, 90 e 120min após inalação de 99mTc-Exametazima-liposomas. Para além da deposição pulmonar elevada, observa-se uma grande captação pelos gânglios axilares. Nas imagens abdominais aos 60, 90 e 120min observam-se nódulos linfáticos da cadeia da aorta abdominal e das cadeias inguinais.

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A actividade média/pixel em cada ROI, após correcção de background e de decaimento, foi usada para obter curvas de actividade-tempo regionais, mostrando as variações biocinéticas do radiotraçador em determinadas zonas alvo durante o estudo (fig. 3). A actividade total foi medida nos pulmões pós-inalação, bem como a taxa de desaparecimento (t1/2=77min) (fig. 3A). Um aumento de actividade foi simultaneamente observado nos gânglios linfáticos axilares, atingindo valores máximos para os nódulos axilares e inguinais±60min (fig. 3B-D).

Figura 3.

Curvas tempo-actividade que representam a cinética do 99mTc-Exametazima-liposomas nos pulmões (A), gânglios axilares (B), gânglios periaórticos (C) e gânglios inguinais (D). Os gráficos C e D começam apenas aos 60min, uma vez que a dimensão do colimador não permite uma aquisição dinâmica simultânea a nível do tórax e do abdómen.

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Promovendo movimento passivo das patas posteriores, após injecção de uma solução de 99mTc-Re2S7, o nódulo linfático inguinal esquerdo foi visualizado aos 45min, correspondendo à área visualizada com 99mTc-Exametazima-liposomes (fig. 4A). No animal controlo, a biodistribuição da 99mTc-Exametazima mostrou um rápido desaparecimento dos pulmões através da permeabilidade alveolo-capilar, o que permitiu uma rápida visualização de vários órgãos (fígado, vesicular biliar, baço, rins e cólon ascendente e transverso) (Product datasheet, Ceretec®, 2001). No entanto, os gânglios linfáticos não eram evidentes, uma vez que a actividade abdominal mascara as cadeias linfáticas abdominais (fig. 4B).

Figura 4.

Imagens dos animais-controlo. A sequência de imagens dinâmicas da linfocintigrafia indirecta obtida durante os primeiros 30min após injecção interdigital patas posterioresde 99mTc-Re2S7, bem como imagens estáticas aos 60, 90 e 120min. A drenagem linfática abdominal observada corresponde às áreas visualizadas com liposomas marcados com 99mTc-Exametazima. B. A biodistribuição de 99mTc-Exametazima é um controlo e não permite visualizar os nódulos linfáticos nem cadeias linfáticas abdominais. Apenas se observa actividade torácica e abdominal difusa.

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De acordo com os princípios MIRD4, e aplicando o método da fracção absorvida para calcular a dose absorvida, os valores obtidos foram semelhantes aos usados nos exames de rotina de Medicina Nuclear convencional para avaliação da permeabilidade alveolo-capilar com aerossóis39,40.

A rede linfática pulmonar desempenha um papel fundamental na taxa de desaparecimento a nível alveolar e intersticial, sendo responsável pela remoção de muitas substâncias, partículas, poeiras ou agentes patogénicos. A drenagem linfática preferencial correlaciona-se com componentes de superfície específicos, tais como os que estão presentes em microrganismos.

Este trabalho de investigação descreve os resultados obtidos em estudos animais in vivo realizados em babuínos, utilizando a referida formulação (99mTc-Exametazima-liposomas), administrados sob a forma de aerossol, como um agente de diagnóstico por imagem para visualização da drenagem linfática profunda do pulmão.

Este sistema transportador poderá ser usado para visualização e/ou terapia, consoante encapsular um agente imagiológico ou um fármaco para terapia. Dado que os componentes aniónicos são rapidamente removidos pela rede linfática, os liposomas unilamelares de pequenas dimensões e negativamente carregados foram produzidos por extrusão através de membranas de policarbonato com poros de 100nm41.

Uma vez que o 99mTc tem um período de meia vida de 6h, a marcação da fase aquosa dos liposomas foi efectuada após a sua produção e imediatamente antes da administração7,11,18,23,24,34,42. Foi efectuada a extrusão sob pressão moderada, dado que a inalação liposomal implica a ausência de solventes orgânicos ou detergentes na solução, para evitar possíveis reacções alérgicas11.

A estabilidade in vivo dos liposomas pode ser alterada pela agressão do complemento, dependendo da composição lipídica da membrana10. Para avaliar estes efeitos disruptivos foi testada a estabilidade in vitro de 99mTc-Exametazima-liposomas através da incubação com soro fisiológico, soro humano fresco, plasma e albumina sérica humanos (4mg/ml), tal como anteriormente foi descrito. Os resultados mostram um aumento estatisticamente significativo da eficiência de marcação na presença de soro e plasma humanos para a formulação estudada (t=3,2; p=0,01). Isto demonstra que os fluidos biológicos não induziram perca do conteúdo aquoso dos liposomas. A estabilidade à ultrasonicação foi determinada analisando a eficiência de marcação após a acção de US a 2,7MHz. Os resultados não mostram diferenças estatisticamente significativas para as eficiências de marcação pré e pós-acção dos US, como foi previamente mencionado por outros autores37,41–45.

A estabilidade liposomal foi também estudada em termos de perca de conteúdo encapsulado (fig. 1B) durante 5,5h. Os resultados mostram uma perca progressiva do conteúdo aquoso, provavelmente devida à constituição lipídica.

O aerossol liposomal inalado atingiu a membrana alveolo-capilar pulmonar. As vesículas podem ser removidas porque atravessam a superfície alveolar para o interstício pulmonar após fagocitose pelos macrófagos alveolares ou mesmo directamente através dos espaços intercelulares ou pela via mucociliar. Os liposomas que atravessaram o interstício foram eliminados por drenagem linfática para os gânglios linfáticos e, subsequentemente, pelos vasos capilares sanguíneos46–48.

Anatomicamente, os linfáticos pulmonares podem ser agrupados em duas redes interligadas: a superficial pleural, localizada no tecido conjuntivo da pleura visceral, e uma profunda intrapulmonar, que forma os linfáticos peribronquiovasculares, localizada no tecido conjuntivo dos folhetos das árvores brônquica e vascular. Podem ver-se vários capilares linfáticos nas áreas justa-alveolares, em continuidade com a parede alveolar e separados do lúmen alveolar apenas pelo epitélio alveolar e tecido conjuntivo de suporte (geralmente muito fino e ricamente vascularizado). Os linfáticos pulmonares existem também no tecido conjuntivo laxo de suporte das células pleurais periféricas, cobrindo os lobos pulmonares, septos interalveolares e folhetos perivasculares3–5,41,49.

O mecanismo de remoção também depende das características fisico-químicas e tamanho das partículas. Apenas tamanhos submicrométricos (< 50nm Ø) podem ser depositados na superfície alveolar, sendo drenados posteriormente pelo sistema linfático50. Ao atingir a superfície alveolar, os 99mTc-Exametazima-liposomas atravessam para o interior dos capilares linfáticos das áreas justa-alveolares através dos espaços intercelulares e são englobados pelos macrófagos alveolares, migrando então para os nódulos linfáticos do hilo3–5,41,49,51. No nosso modelo animal, a dose radioactiva relativamente grande depositada nos pulmões não ajudou a identificar estes nódulos. No entanto, a principal via de drenagem linfática de todo o órgão está ligada aos nódulos linfáticos mediastínicos e abdominais periaórticos, pelo que a sua visualização nas imagens está de acordo com os dados anatómicos (fig. 2)1–5,41,49,51. Existe uma drenagem linfática rápida infra-abdominal pós-inalação, confirmada pela linfocintigrafia indirecta. Esta taxa de desaparecimento pode provavelmente explicar as metástases à distância dos tumores do pulmão que aparecem em locais menos comuns.

Os aerossóis de 99mTc-Exametazima-liposomas especialmente construídos provou ser uma aproximação interessante para o estudo da drenagem linfática profunda do pulmão. O comportamento fisiológico deste sistema transportador de fármacos, que mimetiza algumas propriedades de microrganismos, permitiu visualizar a via linfática descendente para as cadeias ganglionares aórticas abdominais, confirmando-se pela linfocintigrafia indirecta. Imagens destas cadeias podem ser bastante relevantes no estadiamento de tumores do pulmão, bem como na avaliação de outras patologias com contribuição importante da via linfática pulmonar. Além disso, esta metodologia pode desempenhar um papel importante na libertação controlada dirigida para um alvo específico de outros fármacos, como por exemplo agentes terapêuticos citotóxicos.

Tendo em vista os resultados promissores obtidos nos modelos animais testados, perspectiva-se a produção de um sistema traçador, para administração por via inalatória, que forneça informação sobre o grau de invasão e metastização através de imagens funcionais.